1. Sel-sel yang akan diawetkan hendaklah dalam keadaan pertumbuhan yang baik (fasa log) dan kadar kemandirian yang tinggi, dengan ketumpatan kira-kira 80-90%.
2. Periksa sama ada sel masih mengekalkan sifat uniknya sebelum membeku.
Sebagai contoh, hibridoma perlu diuji untuk pengeluaran antibodi satu hingga dua hari sebelum cryopreservation.
3. Beri perhatian kepada kualiti cryoprotectant.
DMSO hendaklah gred reagen, steril dan tidak berwarna (ditapis dengan 0.22 mikron FGLP Telflon atau produk steril yang dibeli secara terus, seperti Sigma D-2650), diasingkan dalam jumlah kecil 5-10 ml, disimpan pada suhu 4 oC dalam gelap. Jangan defrost beberapa kali. Gliserol juga hendaklah daripada gred reagen dan disimpan dalam gelap selepas autoklaf. Gunakan dalam tempoh satu tahun selepas dibuka, kerana ia akan menjadi toksik kepada sel selepas penyimpanan jangka panjang.
4. Kepekatan sel untuk cryopreservation:
(1) Fibroblas manusia biasa: 1~3 x 106 sel/ml
(2) Hibridoma: 1~3 x 106 sel/ml, kepekatan sel tidak boleh terlalu tinggi, sesetengah hibridoma akan mati selepas dicairkan 24 jam kerana kepekatan beku yang tinggi.
(3) Garis tumor yang melekat: 5~7 x 106, bergantung pada jenis sel. Adenokarsinoma memerlukan kepekatan yang lebih tinggi selepas pencairan, manakala HeLa hanya memerlukan 1-3 x 106 sel/ml.
(4) penggantungan lain: 5~10 x 106 sel/ml, limfosit manusia mestilah sekurang-kurangnya 5 x 106 sel/ml.
5. Kepekatan cryoprotectant ialah 5 atau 10% DMSO. Jika keadaan pembekuan sel tidak menentu, budaya sandaran harus digunakan semasa pengawetan krio untuk mengelakkan kegagalan pembekuan.
6. Kaedah pembekuan:
(1) Kaedah tradisional: 4 oC 10 minit ---> -20 oC 30 minit ---> -80 oC 16-18 jam (atau semalaman) ---> Penyimpanan jangka panjang dalam fasa wap tangki nitrogen cecair .
(2) Penyejukan program: Gunakan mesin penyejukan berkelajuan malar untuk mengurangkan daripada suhu bilik kepada –120 oC pada kadar –1 ~ -3 oC/min, dan simpannya dalam fasa wap tangki nitrogen cecair untuk tempoh yang lama. simpanan jangka. Ia sesuai untuk pemeliharaan sel penggantungan dan hibridoma.
7. Bahan:
(1) Sel kultur yang tumbuh dengan baik
(2) Sederhana segar
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Tiub cryopreservation plastik steril (Nalgene 5000-0020)
(5) 0.4% w/v trypan biru (GibcoBRL 15250-061)
(6) Plat hemocytometer dan kaca penutup
(7) Mesin penyejukan halaju malar (KRYO 10 Siri II)
8. Langkah-langkah:
(1) Tukar separuh atau jumlah penuh medium sehari sebelum pembekuan, dan perhatikan pertumbuhan sel.
(2) Penyediaan larutan cryopreservation (penyediaan sebelum digunakan): Tambah DMSO ke medium segar, kepekatan akhir adalah 5-10%, gaul rata, dan letakkan pada suhu bilik untuk kegunaan kemudian.
(3) Mengikut operasi subkultur sel, kumpulkan sel yang dikultur dan ambil sedikit penggantungan sel (kira-kira 0.1 ml) untuk mengira kepekatan sel dan kadar kemandirian sebelum membekukan.
(4) Centrifuge, keluarkan supernatan, tambahkan jumlah larutan kriopeservasi yang sesuai untuk menjadikan kepekatan sel 1-5 x 106 sel/ml, gaul rata, dan tuangkan ke dalam tiub kriopreservasi berlabel, 1 ml/vial, dan Ambil sebiji kecil jumlah penggantungan sel untuk pengesanan pencemaran.
(5) Kaedah pengawetan krio 1: Cryotube diletakkan pada suhu 4 oC selama 10 minit → -20 oC selama 30 minit → -80 oC selama 16 hingga 18 jam (atau semalaman) → fasa wap tangki nitrogen cecair untuk penyimpanan jangka panjang.
(6) Kaedah penyimpanan beku 2: Tiub pembekuan diletakkan di dalam mesin penyejukan halaju malar dengan atur cara yang ditetapkan, dan kemudian diletakkan di dalam tangki nitrogen cecair.
英语
阿拉伯语
���ļ���